高等植物dna提取和纯度鉴定离心的目的
是除去溶液中的固体杂质。高等植物dna提取和纯度鉴定离心的目的是除去溶液中的固体杂质。DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。植物染色体DNA的抽取及浓度测定
目的意义DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。
Ⅰ 植物基因组DNA 的提取（CTAB法）
一、原理
植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：
（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。
（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。
（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。
（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。
（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。
分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。
二、操作方法
（1） 取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中，加入600μL DNA提取液，颠倒混匀5-6次。65℃保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。
（2）再加等体积的氯仿异戊醇(24：1)溶液轻轻摇晃30秒，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液(450μL)
（3） 再加两倍体积的预冷异丙醇，混匀静止10分钟以上，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，弃上清。
（4） 用600μL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。
（5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37℃下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。
Ⅱ 植物DNA 纯度的鉴定——紫外分光光度计法
一、原理
由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
纯度鉴定时，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明，
纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。
含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用中可根据260nm处的消光值O.D260值换算成含量，一般认为O.D260值为1时，相当于50μg/ml。在测定核酸粗制品时，样品中残留的蛋白质和色素等与其它具紫外吸收的杂质对测定有明显干扰作用，大分子核酸制备过程中变性降解后有增色效应，因此有时此法测定的结果会高于定磷法。
二、实验材料、仪器及试剂
1、材料 植物DNA
2、器材：紫外分光光度计、移液管、试管
3、试剂：TE溶液（pH8.0）（见前述）
三、操作方法
将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50μg DNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm吸收值，计算A260/A230和A260/A280的比值，并换算出核酸的含量。
Ⅲ 植物DNA 分子量的测定——琼脂糖凝胶电泳法
一、原理
以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究中，其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。DNA分子在高于其等电点的pH溶液带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小构象有关。实验表明DNA迁移率与其分子量的对数成反比。因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品DNA的分子量。用低浓度的荧光物质，插入性染料溴化乙锭（EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可直接显示DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng（10-9g）或更少的DNA含量。
二、实验材料、仪器及试剂
1、材料： 植物DNA
2、器材：水平板型电泳槽装置 电泳仪 254nm波长的紫外分析仪塑料手套 移液管 水浴锅
3、试剂：
（1）T ris-HAc(TAE)缓冲液
A．浓缩的贮备液（50倍）每升含：242gTris 57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。
B．使用浓度：0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA。
（2） 琼脂糖：电泳纯以上。
（3）溴酚蓝甘油溶液（0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液）：先配制0.1%溴酚蓝水溶液，然后取1份0.1%溴酚蓝溶液与等体积的甘油混合即成。
（4）已知分子量的标准DNA（λDNA-ECORI/Hind III）。
（5） 10mg/mL溴化乙锭水溶液（EB）或GV水溶液。
三、操作方法
1．琼脂糖凝胶板的制备
称取0.7g琼脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE缓冲液，在沸水浴中加热至琼脂糖完全溶解，冷却至50℃，然后加入EB溶液使终浓度为0.5μg/ml。倒入凹形有机玻璃槽（事先用胶带封住有机物玻璃板的边缘）。使其成2mm左右的凝胶板。在其未凝固前将样品槽模板（梳子）插入凝胶的一端，注意梳齿底与凝胶底之间应至少保持0.5-1.0mm的凝胶。待全部凝固后（室温，约30-45分钟），取出梳子及除去胶带，将凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内，加入TAE缓冲液使刚好超过凝胶面约1mm。
2．加样：将样品与溴酚蓝按4：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5μgDNA。
3．电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，如100伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每厘米
5伏特左右的电压，DNA在电泳中向正极移动。当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部1-2cm，停止电泳，当胶板为10-15cm的长度时，电泳时间一般为2小时左右。
(4)观察与鉴定
电泳结束后，取出凝胶板，在波长为254nm的凝胶成像系统下，观察电泳图谱，如果电泳条带清晰(如果EB染色看到桔黄色荧光条带，GV染色则看到绿色荧光条带)，将凝胶照相。根据标准DNA的电泳图谱，可以得知样品DNA的分子大小。
蚕怎么分辨公母
问题一：怎样分辨蚕的公母 蚕的卵、幼虫（蚕宝宝）、蚕蛹、蚕蛾身体上一些特征，都可以用来鉴别雌雄性别。但是应用最广的是，识别老龄蚕宝宝、蚕蛹和蚕蛾的雌雄。识别蚕宝宝雌雄，最可靠的特征，是腹部第八、九节：雌蚕第八、九节腹面有四个透明小点；雄蚕第九节腹面中央，有一个透明小点。
识别雌雄蛹的特征，也是利用腹部第八、九节处的构造。雌蛹的腹部第八、九节腹面中央，有一条直线，把第八、九节从中恭隔开来；而雄蛹的腹部第九节腹面中央，有一对小突起。
至于雌雄蛾的分别，除掉鉴别触角、腹部大小等特征外，最可靠的是鉴别雌雄蛾的外生殖器，例如雌蛾的交配孔附近有一片黑色骨板，雄蛾有成对的抱握器等。
蚕上蔟后经4天左右化蛹，蚕蛹蛹体呈纺线形，分头、胸、腹三个体段，头部很小，在其腹面长有一对复眼和一对触角；胸部有3个体节和3对胸足、2对翅；腹部有9个体节，在第8腹节腹面正中有“x”形的线纹，第9腹节腹面正中有一个褐色小点，分别为蛹期雌雄性别的体表特征，蚕种繁育上往往以此为依据在蛹期鉴别区分雌雄。蚕刚化蛹时，蛹色淡黄，蛹体嫩软，随蛹龄推进逐步变为黄色、黄褐色和褐色、蛹皮也渐趋硬化。蛹期经过约12一15天，待蛹体再度受柔，蛹皮适度起皱呈土褐色，则已接近发蛾。蚕蛹富含营养，可作食品或饲料，也可提炼蛹油和蛹蛋白作化工或医药原料
问题二：怎样看出蚕的公母呢？ 我在参观中国科学院上海植物生理生态研究所时，发现很多研究人员都在解剖家蚕，小蚕宝宝非常可爱。我问这些研究人员是否可以在外形上区分家蚕的性别，但是了解到只能在蛹期和成虫期才能鉴定。那如果蚕农伯伯在蚕业生产上需要尽早知道所养的是雄蚕还是雌蚕，以便根据自己的需要来调节或选择，是否可在幼虫期鉴定性别呢？研究人员说可以尝试用先进的DNA标记技术来对家蚕幼虫的性别进行鉴定。
一、实验意义：
1、 家蚕是一种经济昆虫，与人类的关系密切。蚕丝是我国古代的一项发明，对人类物质文明与精神文明做出过重要的贡献。通过家蚕饲养，对家蚕的生活史有更深的理解，同时可更好地了解家蚕产生蚕丝的过程。
2、 地球上几乎所有的生物都以DNA (脱氧核糖核酸) 作为遗传物质，DNA 是生命活动的基础。通过本实验，可了解和掌握如何从生物组织中提取得到DNA。而从实验中所得到的家蚕DNA又可以在以后用于家蚕的遗传分析，研究家蚕产生蚕丝的质量调控机理，同时为家蚕的品种选育提供指导，以培育优良的家蚕品种。另外本实验是生物学实验的基础，所有家蚕分子生物学的实验都在此基础上展开。
3、家蚕早期性别的区分对蚕丝生产有着重要的意义。雄蚕由于体格强健，感染病原菌的可能性低，而且产出的丝比雌蚕多，同时雌蚕在制种时又有较多的需求，因此在蚕业生产上希望多饲养雄蚕。但通过外形来鉴定蚕宝宝的性别，只能在蛹和成虫期进行，本实验在幼虫期就可鉴定蚕宝宝的性别，解决了蚕农伯伯在蚕业生产上需要尽早知道所养的是雄蚕还是雌蚕这一难题，在蚕业生产上有重要的经济意义。除此之外，区分雌雄蚕的关键是在于来自父本和母本的遗传信息上存在差异，通过相关标记的开发，可以了解到生物遗传的基本规律。
二、实验目的：
1、掌握家蚕的饲养方法。
2、初步掌握家蚕DNA的提取方法和原理。
3、了解紫外分光光度法测定核酸浓度、纯度的原理、意义和操作方法。
4、利用DNA标记技术鉴定蚕宝宝幼虫的性别。
三、实验原理：
1. 家蚕饲养：
家蚕属于完全变态昆虫，在一个世代中经过卵、幼虫、蛹和成虫四个形态完全不同的发育阶段。成虫交配后再产下下一代，完成整个生命周期。
2. DNA抽提
DNA是生物生命信息的基本内容，通过提取获得目标个体的DNA以便进行进一步的分析。在DNA提取中，所得到的DNA的纯度是衡量本实验是否成功的标志，期间要去除对DNA的纯度影响最大的杂质：蛋白质和RNA。其关键点为：1)用蛋白酶K酶解蛋白；2)用有机溶剂将蛋白质变性，再通过离心作用沉淀蛋白质；3)用RNA酶将RNA 酶解以避免抽提中RNA对DNA的影响
3. 性别区分
家蚕是真核细胞生物的一种。它们的遗传物质分别来自于父本和母本。母本的合子是ZaW，而父本的合子是ZbZb。雌性中Za与雄性Zb的差异会在后代中得以体现。如果是雌性后代，合子为ZbW，如果是雄性后代，合子为ZaZb, 反映在DNA条带上就是雌性为一条带，雄性为两条带。
四、实验材料：
1、 家蚕的卵（用于家蚕的饲养）。
2、 从饲养中获得的家蚕的五龄幼虫（用于DNA的提取和性别鉴定）。
五、实验步骤：
1、 家蚕的饲养：
家蚕以卵繁殖，约经10天左右孵化成幼虫。卵在孵化前2天左右颜色会变黑。刚孵化的幼虫，体呈褐色，形似蚂蚁，又叫蚁蚕。蚁蚕通过摄食迅速生长，体色逐渐变淡转呈青白色。幼虫生长到一定程度时需蜕去旧皮，生伐为较宽大的新皮再继续生长，这称为蜕皮。家蚕在蜕皮过程中，新皮形成时需要睡觉，称为眠。眠又是划分蚕龄的界限，蚁蚕摄食后称第1龄蚕，第一次眠后称第2龄蚕，依次类推，第四次眠后称第5龄蚕。每个龄期......>>
问题三：如何分辩蚕的公母 图片 桑蚕是有雌雄的，不过要到4-5龄大蚕的时候才能分的出雌雄，雌蚕在蚕的尾部第八和第九腹节腹面，左右对称地各有一对乳白色的小圆点（共四点），分别称生殖前盘和生殖后盘，雄蚕则在第八和第九腹节的腹面交界处中央显有一个椭圆形的小点，称小囊体。
问题四：如何分辨蚕的雌雄 识别蚕宝宝雌雄，最可靠的特征，是腹部第八、九节：雌蚕第八、九节腹面有四个透明小点；雄蚕第九节腹面中央，有一个透明小点。
zhidao.baidu/question/50186834
问题五：蚕茧怎么分辨公母 分不出来，蚕蛹化蛾后才分得出来。公蛾小一点，母蛾大一点阀―特别是肚子。
你的茧有黄有白可能是蚕种的原因，也有可能是蚕茧受污染了，跟公母没关系。
问题六：怎样区分蚕的公母 蚕的卵、幼虫（蚕宝宝）、蚕蛹、蚕蛾身体上一些特征，都可以用来鉴别雌雄性别。但是应用最广的是，识别老龄蚕宝宝、蚕蛹和蚕蛾的雌雄。 蚕是没公母之分的，只有变成蚕蛹后才能看出公母。公地细小些，母的粗大 蚕个大、粗， *** 圆的为母蚕，公蚕个稍小， *** 细尖。 蛹更好认公母，母大公小，古时配对交尾，一般是一配一，万一缺少公蛾，也要第二天再配另一母蛾，以保证坐仔（产仔）质量。为确保坐仔好，还要看公蛾动态，如翅膀无力扇动，爬动不勤，要丢掉，坐仔配对要用簸箕盖，一是要安静，二是背强光，仔坐在树皮上 识别蚕宝宝雌雄，最可靠的特征，是腹部第八、九节：雌蚕第八、九节腹面有四个透明小点；雄蚕第九节腹面中央，有一个透明小点。
问题七：怎么区分蚕的公母 蚕在第四龄的时候，身体变大了，比较容易鉴别公母：蚕体从尾部算起，雄蚕在第二、三环节之间，有一个凸出的小圆点，叫做海洛尔特氏腺；而雌蚕在倒数第二、三环节的下面，有四个凹形小圆点，叫做石渡氏腺。
问题八：蚕怎么分公母图片 蚁蚕第一次蜕皮前的时候辨认方法：
小而黑的是雄蚕，相对颜色浅而个大的是雌蚕。
大蚕的辨认方法：
长大了都变成白色，看 *** ，尖的是雄性，圆的是雌性。
老龄蚕（幼虫）的辨认方法：
雌蚕第八九节腹面，有四个透明小点，雄蚕第九节腹面中央，有一个透明小点。
蛹的辨认方法：
雌蛹的腹部第八九节腹面中央，有一条直线，把第八九节从中分隔开来，而雄蛹的腹部第九节腹面中央，有一对小突起。
（成虫）蛾的辨认方法：
雌蛾的交配孔附近有一片黑色的骨板，而雄蛾的外生殖有成对的抱握器。
问题九：蚕怎样分辨公母 蚁蚕第一次蜕皮前的时候辨认方法：
小而黑的是雄蚕，相对颜色浅而个大的是雌蚕。
大蚕的辨认方法：
长大了都变成白色，看 *** ，尖的是雄性，圆的是雌性。
老龄蚕（幼虫）的辨认方法：
雌蚕第八九节腹面，有四个透明小点，雄蚕第九节腹面中央，有一个透明小点。
蛹的辨认方法：
雌蛹的腹部第八九节腹面中央，有一条直线，把第八九节从中分隔开来，而雄蛹的腹部第九节腹面中央，有一对小突起。
（成虫）蛾的辨认方法：
雌蛾的交配孔附近有一片黑色的骨板，而雄蛾的外生殖有成对的抱握器。
问题十：蚕怎么分公母？ 是桑蚕吗？
教你你个方法，先喂一段时间，等它结茧，茧子黄的就是母的，白的就是公的
还有个方法：雌蚕在蚕的尾部第八和第九腹节腹面，左右对称地各有一对乳白色的小圆点（共四点），分别称生殖前盘和生殖后盘，雄蚕则在第八和第九腹节的腹面交界处中央显有一个椭圆形的小点，称小囊体。
如何通过qpcr看一个基因的表达丰度
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：
A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
G. 反应体系的设置：
A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不 同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。
设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！
五、Real-time qPCR数据分析
1. Real-time qPCR常见参数
基线（baseline）
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（threshold）
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。
2.影响Ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
3. 如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。
常见问题
1. 无Ct值出现
检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。
模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2. Ct值出现过晚（Ct>38）
扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。
3. 标准曲线线性关系不佳
加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。
标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。
模板中存在抑制物，或模板浓度过高
4. 负对照有信号
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5. 溶解曲线不止一个主峰
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
6. 扩增效率低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？
参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)
模板的浓度太高或者降解
荧光染料的降解
荧光定量PCR问题汇总
1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？
按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？
定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：
3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？
当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以 分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一 起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。
· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
· 单击碎片整理(Defragment)。
· 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
· 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4. 何时执行windows service pack更新？
不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。
5. 应该备份哪些数据？
应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。
6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？
良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：
电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风：仪器的通风应该没有阻挡。
温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。
湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。
空间：易于操作，安全。
7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？
一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。
另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。
清除样本加热块污染的步骤如下：
用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。
吹打数次。
将废液吸入废液杯中。
重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。
确认反应孔中的残留液体蒸发完。
8. 什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？
背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收 集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数 据中扣除背景信号。
因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。
9. 什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？
纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后 每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样 品中的荧光染料种类和信号强度。
推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎样封膜？
当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。
11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置？
使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后 逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.
12. 绝对定量与相对定量有什么区别？
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。
绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。
相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为 简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。
CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。
绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。
相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。
13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？
总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。
首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的 荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。
其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。
第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。
14. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？
假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：
15.什么是CT值比较法？数据怎么处理？
CT值与起始DNA浓度的对数成反比：
如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。
16. 每个反应管中可以加入多少种探针？
每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。
首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制 的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为 例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。
其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不 重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。
第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种 荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样 做），还可以再多一种荧光用于标记探针。
第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。
最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加 入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花 费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。
在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。
17. 等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正？
不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。
由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。
这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。
18. 内标法和外标法哪种数据更精密？
是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它 们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。
2. 蛋白质组学样品前处理（2）
说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。第一步：剪碎去血
将样品放入PBS缓冲溶液中剪碎，倒掉变色的溶液，换入新的PBS，继续剪，一遍一遍地重复，直到PBS溶液不变色为止。比如肝脏组织，洗完后整个是一个偏黄色的组织。在这个过程中，我们需要用剪刀和镊子剥离血管组织和脂肪组织等，这些组织的存在会对我们对样品，比如肝脏组织的蛋白质类型产生干扰。去血的过程中同时需要加入蛋白酶抑制剂。
第二步：称重
为了称量更精确，洗涤之后可以用滤纸将样品吸干，然后再称重，能比较准确地知道我们大约使用了多少组织样品。
第三步：碎裂
碎裂样品的方法在上一篇推文里有详细的介绍，包括液氮研磨、匀浆等机械破碎，温差法、压力法等物理破碎，以及加入变性剂等化学处理法。通常情况下呢，用液氮研磨就够了，研磨到完全变成粉状。但如果用单一的方法破碎效果不好，或者操作起来工作量太大，也可以进行多方法的组合。比如十几个或几十个样品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的运动量估计也差不多了，累成狗！这时候可以考虑使用组织破碎仪，一次可以做八个十个的，一起震碎，那就轻松多了。
第四步：裂解
破碎以后，加入裂解液，反复震荡，让样品充分溶解，裂解液的用量通常是
组织重量：裂解液的体积=1：5
也就是说，1克组织，通常加入5ml的裂解液。
在裂解时，眼睛不要只顾着看手机或者盯着天花板发呆，要好好观察样品的情况，如果发现仍然有大块的组织，或者很多絮状的组织，则说明上一步碎裂的工作做得还不够。这时可以加入超声的方法，或者用组织匀浆器进一步碎裂，从而保证蛋白提取比较成功。
有哪些裂解液可选呢？
第五步：离心
裂解并震荡以后，4℃ 12000rpm离心半小时，然后吸取上清液。
说到这里，插一句，以往的经验，常规小鼠和人的组织样品，提取效率大约为0.7%，也就是说，如果有100mg的组织，能提到的蛋白大概是700 μg 。做常规的质谱分析，有100-200mg的蛋白就够了。如果样品充足，我们可以分成几份，先提取一部分做实验试试，整个流程走下来没问题的话，再提一部分，这样也比较保险，不会出现全军覆没的惨剧。余下的样本，还可以做做Western验证或者酶活啥的。
如果样品量特别少，例如小鼠卵巢，一共也就黄豆那么大，这种情况下可不能用液氮研磨，因为大部分样品都会被刮到研钵的壁上，损失很大！可选的方案是：将小鼠卵巢放进试管里，直接在管子里剪碎去血，加入裂解液，用组织破碎仪或者超声破碎，也可以用4%SDS提取（ 95℃，5分钟）。这种情况就不要弄太多的碎裂步骤了，步骤越少，样品的损失就越少。
针对动物细胞样品的处理方法有很多，我们来看看几种常见的套路：
A． 最简单的方法：
把细胞从培养皿里取出来，先加入PBS把培养基洗掉，再加入裂解液，通常25mm的培养皿加入400-700μL裂解液。然后用细胞刮直接刮取培养皿表面，不停地刮，相当于是一个机械力的破裂，而细胞表面是最容易进行破裂的。刮完后收集裂解液和细胞样品到EP管里，然后进行冰上裂解。这是最快最直接有效的方法。
B．多组细胞平行实验处理方法：
当需要处理多组细胞，而每组细胞培养的时间有间隔时，如果希望后续的分析是平行的，那么可以先分别胰酶消化以后，收集每组细胞，液氮或者-80℃保存。等各组细胞都收集好后，加入裂解液，不超过200W超声，放在冰上操作。由于不能用SDS（超声时会引起大量的泡泡），这种情况下，常用的是8M尿素或2M硫脲。超声一定要在冰上进行，因为温度特别高，很容易超过37℃，循环周期的时间通常会设定为：5秒超声，停4-5秒，再5秒超声，反复，整个过程持续5分钟左右。
C．反复冻融法：
这种方法用得比较少，因为残留的细胞残片还是比较多，我们认为提取是不充分的。
D．化学处理法：
也是非常简单粗暴的方法，直接加入4%SDS，95℃水浴，1-5分钟即可。
通常情况下，我们要求细胞量需要达到1E6的数量级。当然，有一些新发展出来的方法，需要的细胞量会非常少，比较南方医科大学田瑞军老师课题组做过1000个细胞的蛋白提取，但这些新方法对操作的要求也很高，如果你还是个新手，没有足够的经验，直接拿新方法来做，风险就会比较高了。
对于这类样品的处理，去石蜡是比较麻烦的事情。在石蜡包埋过程中，样品中的蛋白质或脂肪会用福尔马林或甲醇固定，形成交联状的结构，从中提取蛋白是非常困难的。难归难，遇到了还是要迎难而上，咱们得想一些合适的办法把蛋白有效地提取出来。通过很多次的摸索和实践，以下是比较可行的处理步骤：
第一步： 去石蜡，先用二甲苯室温浸泡5分钟，两次，再换甲醇室温浸泡5分钟，两次。看起来很简单，但整个过程中会经过混旋。
第二步： 蛋白裂解，因为蛋白被福尔马林或甲醇固定得非常紧了，有的人会选择加入水，让样品泡涨，我们更推荐加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白样品，然后匀浆和超声。
第三步： 水化之后，加入4%SDS。对于4%SDS，通常的处理条件是95℃，5分钟，但对于石蜡样品，交联特别厉害，所以推荐95℃下处理60分钟，再冷却到室温。
第四步： 离心，参数为最大相对离心力16,000 g，离心10分钟，取上清，就达到分离的目的了。
石蜡包埋样品提取的效率通常是，一平方毫米样品可提取一微克蛋白，大家可以通过这个效率值对样品中能提取的蛋白进行估算。
对于植物组织样品，难点就在于细胞壁及叶绿素的去除。
第一步： 充分再充分地研磨。由于细胞壁十分强壮，所以一定要好好地研磨，充分碎裂。一般的匀浆根本搞不定细胞壁，没办法碎得充分。
第二步： 去色素。可以通过有机溶剂多次反复沉淀样品来去除色素，比如丙酮、TCA（三氯乙酸）、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的样品，这样可以把叶绿素去掉。
第三步， 离心取沉淀，然后加入裂解液，让蛋白充分地溶解。
第四步： 进行蛋白质的抽提。在抽提的过程中，要看细胞的破碎程度或者样品的类型，叶片样品相对来说比较简单，茎的样品比较麻烦，它的纤维组织比较大，再加上植物细胞壁又比较厚，所以我们得用超声、震荡，以及各种方法组合，进行蛋白质的抽提。
第五步： 离心取上清，就得到了蛋白溶液。
根据以往经验，像叶片这类的样品，处理起来比较简单，例如水稻的叶片组织提取出来可以做到8000多个蛋白；根的样品稍微麻烦一点，因为含水量特别多，先得烘干，尽量去掉它的水份，干燥后再进行研磨提取。否则，我们可能会加入很多根，但其实能提取的样品并没有多少。花的组织，比如桃花、梨花，也是水分太多的问题，需要先干燥。种子组织，例如花生，在破碎成粉后，也需要多次使用有机溶剂去掉它的脂肪。
总之，根、茎、叶、果实等，根据不同的样品类型，我们需要根据它的特点设计不用的处理步骤，简单来说，就是通过有机试剂去掉它的色素和脂肪组织，水分太多的先烘干再提取，常规情况就是研磨和去色素。大家清楚了各种处理的用处之后，就可以针对自己的样品灵活地处理了。比如棉花样品，因为它纤维特别多，你可能就会想到得通过研磨和反复沉淀来进行纯化，再进行后续分析。
与植物样品类似，细菌样品的细胞壁也是我们提取蛋白的最大障碍，尤其是像革兰氏阳性菌，以及一些细菌的亚型，细胞壁特别厚，破碎的时候需要更强的参数，更长的时间。
刘晓慧老师分享了两个她遇到的例子：有一次做细菌样品，不巧它就是一个细胞壁特别厚的亚类，最开始采用急热骤冷，即从-80℃冰箱取出，95℃煮1分钟，反复几次，然后超声，但是提出来的蛋白量特别少。最后还是用了液氮研磨的方法，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白。所以，对于细菌的样品，我们可以尝试多种方法，测试一下。
还有一次做酵母样品，在做超声的时候，因为有点事情离开了，所以超声的时间就特别长，并且几次超声之间做了急热骤冷处理。另一位同事使用同样的方法，只是超声时间比较短。最后发现超声时间长的样品，破碎地非常好，显微镜下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多，而超声时间短的提取到的蛋白就少很多。所以我们在碎裂样品时，也可以多尝试几种方法，几种参数。
体液样品难点在于高丰度蛋白的去除。以血清为例，前14种高丰度蛋白占血清总蛋白的95%以上。而质谱是一种离子饱和性检测器，低丰度离子的信号很容易被高丰度的抑制，从而无法检测到。
我们有很多办法去掉高丰度蛋白。当然，有些情况下，为了保证样品的完整性，也有人不去除高丰度蛋白，这个视具体情况而定。另外，高丰度蛋白可能还会与一些低丰度蛋白相结合，当我们去掉高丰度蛋白时，往往就会将这些有意义的低丰度蛋白也去掉，无法保证分析的完整性。针对这种情况，用普通的shotgun方法是很难解决的，后面我们会介绍一种方法，它在高丰度蛋白存在的情况下，仍然可以稳定地可重复地鉴定到很多中低丰度的蛋白。
要去除高丰度蛋白，很多商业试剂盒都可以帮到我们。它们的原理各有不同，我们来看几个比较常用的。
第一种是Bio-Rad的Proteominer试剂盒。
这类试剂盒的原理是：通过一个六肽配基与高丰度蛋白结合，从而进行去除。这种方法是非抗体型的，没啥特异性，它不受物种限制和样品类型限制。当样品进来时，六肽配基会优先结合丰度高的蛋白质，丰度低的嘛，结合的机会小很多，于是就达到了分离去除的目的。
通过这个办法处理后，最终能鉴定到的蛋白也是比较多的，从鉴定的数量上看，与安捷伦的特异性试剂盒差不多。但如果要发高分的文章，用这种方法容易受到质疑，也是因为它的特异性不强，去高丰度有一定的随机性，高分杂志不太接受这种随机的方法。但如果你的样品体积特别大，可以先试着用Proteominer做一次，接下来再使用一些特异性的去高丰度蛋白的方法。或者你的样品没有特异性抗体柱可以用的话，也可以考虑这种方法。
第二种是安捷伦的MARS柱。它含有14种蛋白抗体，针对血清中的高丰度蛋白能很有针对性地去除，需要的样品量通常为20μL-40μL，20μL的血清样品可以得到约100微克的蛋白样品，40μL的量足够我们做一次iTRAQ或label free实验了。
第三种试剂盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的试剂盒，可以去两个高丰度蛋白。现在出了一个去20个高丰度蛋白的试剂盒，这是基于抗体方法，针对性很强，是比较公认的方法。
第四种是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns，2015年MCP上发表了一篇文献，里面用到这个试剂盒，先是用特异性柱子去掉14个高丰度蛋白，然后再特异性去掉50个中丰度的蛋白，最后可以鉴定到5300多个血清蛋白质。对比现在常规的方法，通常只能鉴定到500-600个血清蛋白，如果高丰度蛋白去除得比较好，用QE的方法做，也只能鉴定到1000个左右蛋白。这篇文章鉴定出了5300个蛋白质，在血清样品的蛋白鉴定中确实是一个相当outstanding的结果了。
以上是四种比较常用的去高丰度的试用盒。总的来说，针对像尿液这类体积很大的样品，可以用Proteominer的方法，因为其余的基于抗体的方法都对蛋白含量有所要求。去掉高丰度蛋白后，我们可以对尿液先进行浓缩，使它的浓度达到50μg/μL或更高，再进行后续的蛋白提取，效果会更好。另外，尿液样品也可以通过沉淀的方法对蛋白进行提取。
另外，像脑脊液样品，也可以通过Proteominer方法进行提取，它的蛋白含量也比较低。刘晓慧老师组尝试过用安捷伦的特异性去除14个高丰度蛋白的试剂盒与Proteominer的随机去除6个高丰度蛋白试剂盒进行比较，最后能检测到的蛋白结果都差不多。
针对亚细胞器的提取，我们分几步来完成：
第一步： 对组织或细胞进行匀浆，不需要匀得非常碎，通常匀个10-20下就可以了；
第二步： 初步分离，使用差速离心的方法，具体说明见上图。
第三步： 用蔗糖密度梯度离心进行再分离。蔗糖密度梯度是连续的，那么相应的亚细胞器会在等密度的蔗糖密度区间内沉积。于是，可以将溶酶体、线粒体，以及其它微体分开。然后取出对应的细胞器，再进行裂解和提取。
第四步： 对亚细胞器进行验证。这一步需要引入Western，比如用到一些线粒体特异的抗体，或者细胞膜、细胞核特异的抗体，进行样品纯度的确证，之后再进行后续的实验。否则，如果样品中有污染，会给后续的实验带来很难解释的问题。
以上是针对不同样品的蛋白提取方法，下一篇将继续分享样品前处理的余下几步，即蛋白提取的质量控制、脱盐、还原烷基化和酶解。